一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定细菌胞外蛋白酶种类上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用，包括以下步骤：a.制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝胶；b.蛋白酶样品与不含β-巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水浴中加热；c.电泳；d.洗胶；e.将胶在含有不同蛋白酶抑制剂的底物溶液中浸泡；f.反应显色。本发明方法能对不同蛋白酶进行定性，比传统方法在耗时上明显缩短；省去了分离纯化蛋白酶的繁琐步骤；重复性好，灵敏度高，活性条带测定准确，非常有利于后续的蛋白酶鉴定及有目的的纯化工作；可以用于各种蛋白酶类型的检测，有广阔的应用空间。
【专利说明】一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定细菌胞外蛋白酶种 类上的应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白酶种类鉴定【技术领域】，涉及一种利用蛋白酶谱的活性电泳检测技 术和蛋白酶抑制剂反应对蛋白酶种类进行快速鉴定的应用方法。

【背景技术】
[0002] 蛋白酶（proteases, proteinases)也称为肽酶（peptidases)，是一类能水解蛋 白质和多肽水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，执行许多不同的生理功能。 MER0PS数据库记录了蛋白酶及蛋白酶的肽类抑制剂的相关信息，根据催化中心参与催化的 氨基酸的不同，在该数据库中蛋白酶可分成6大类：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷 氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和未知催化类型的蛋白酶。蛋白酶 是用途最广泛的酶制剂之一，占了世界酶类销售总额的60%，在食品、医药、纺织、制革、洗 涤剂、化妆品、动植物蛋白以及废物处理等行业都有着很好的应用前景。
[0003] 蛋白酶抑制剂（protease inhibitor, PI)是一类分子量较小的多肽或蛋白质，它 们能与蛋白酶活性部位或变构部位结合抑制酶的活性。蛋白酶抑制剂根据其作用于酶的活 性部位的不同，分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（巯基蛋白酶抑制剂）、 金属羧肽酶蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。利用蛋白酶抑制剂可以研究蛋白酶活 性中心的催化特性，初步推断蛋白酶的种类。
[0004] 利用蛋白酶抑制剂检测蛋白酶的常规方法为，将蛋白酶与抑制剂混合反应后，根 据福林酚法测定其对酪蛋白的酶活。该方法中使用的如果是纯酶，则可以直观的判断蛋白 酶的类型，但如果是粗酶提取液，结果就不直观，那是由于粗酶液内含多种蛋白酶，利用该 方法，只能粗略判断粗酶液中可能含有哪种类型的酶，并不能直观的看到具体是哪一种或 几种蛋白酶被抑制。
[0005] 本发明针对上述问题进行了技术改进，利用蛋白酶谱的活性电泳产物通过抑制剂 加底物浸泡的方法解决了上述传统方法可能的造成的误差，可有效应用于蛋白酶谱定性的 分析。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种更为快速、准确、简便的检测蛋白 酶种类的新方法，应用该方法，可以不用分离纯化蛋白酶，不使用昂贵仪器，就可直观的对 细菌胞外蛋白酶进行分类。大大的缩短了实验周期，实现对多种蛋白酶谱进行高通量快速 检测。
[0007] 本发明的目的是通过以下方式实现的：
[0008] 一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，包括以下步 骤：
[0009] a.制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝胶；
[0010] b.蛋白酶样品与不含β-巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在 沸水浴中加热；
[0011] c.电泳；
[0012] d.洗胶；
[0013] e.将胶放入含有不同蛋白酶抑制剂的底物溶液中浸泡；
[0014] f.反应显色。
[0015] 步骤a制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝胶的过程如下：配制质量浓度 为 12. 5% 的分离胶：30% w/v 凝胶吧备液 1. 6ml，ρΗ8· 8 的 1. 5mol/L Tris-HCll. 0ml，蒸 馏水1. 4ml，10% w/v过硫酸铵25 μ 1，TEMED2. 5 μ 1 ;混匀后立即将分离胶注入准备好的 玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入lml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的 抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆盖液体；配制5% w/v的上层浓缩胶：30% w/v凝胶贮备 液0.151111，？册.8的0.5111〇1/11'1^8-!1(：10.351111，蒸馏水0.51111，10%￥八过硫酸铵2(^1， TEMED2. 0μ 1 ;插入梳子，避免混入气泡，放置室温下。
[0016] 步骤b中使用的不含β-巯基乙醇的加样缓冲液配方为：60mM Tris-HCl ρΗ6. 8、 SDS2%w/v、溴酚蓝0· l%w/v、甘油25% ν/ν组成，加样时样品和加样缓冲液的体积比为4 : 1〇
[0017] 4、根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应 用方法，其特征在于，
[0018] 步骤C中电泳缓冲液为ρΗ8. 8的Tris-甘氨酸缓冲液；电泳在冰浴中进行；采用垂 直板式不连续系统电泳方法，5mA稳流进样后，10mA稳流分离样品直至溴酚蓝指示剂到达 胶的最前沿。
[0019] 步骤d中电泳结束后，用预冷的2. 5% Triton X-100v/v将胶洗三次，每次15min ; 然后用预冷的蒸馏水漂洗数次去除残留的Triton X-100。
[0020] 步骤e中将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有5mM蛋白酶抑制剂和质量浓 度为0.1-2%底物的溶液中，30-401：温浴1-311。
[0021] 优选将胶浸泡在用pH8. 0的Tris-HCl缓冲液配制的含有5mM蛋白酶抑制剂和质 量浓度为〇. 1%底物的溶液中，37°C温浴lh后用蒸馏水将胶上残留的底物冲洗干净。
[0022] 蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟，1，10-邻菲啰啉。
[0023] 步骤f的具体过程为：用0. 1 % w/v的考马斯亮蓝R-250染色液染色3h,然后用脱 色液脱色直至透明条带清晰，其中染色液配方为：lg考马斯亮蓝R-250, 350ml乙醇，100ml 乙酸，加水至l〇〇〇ml ;脱色液配方为：250ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml。
[0024] 蛋白酶样品来源于将细菌菌株接种于发酵培养基，在相应培养条件下震荡培养 3?4天，4°C，13000rpm离心lOmin后得到的上清液，或是其他来源的蛋白酶液。
[0025] 本发明中所用的底物为酪蛋白或明胶。
[0026] 本发明的优点和有益效果
[0027] 1、现有的蛋白酶抑制剂检测蛋白酶的常规方法是在溶液中将蛋白酶与抑制剂混 合反应后，根据福林酚法测定其对酪蛋白的酶活；但一般检测的是内含多种蛋白粗酶提取 液，那么在多种蛋白酶的混合溶液中只能粗略判断粗酶液中可能含有哪种类型的酶，因此 并不能直观的看到具体是哪一种或几种蛋白酶被抑制，除非对粗酶提取液进行分离纯化， 得到纯酶后再进行检测和鉴定，可想而知，这样的方法很复杂繁琐，耗时耗力。本发明将蛋 白酶抑制剂反应与蛋白酶谱的活性电泳检测技术巧妙的结合在一起，将其应用于蛋白酶种 类的鉴定和检测；开创性的提出了一种蛋白酶鉴定和检测的新方法。该方法通过蛋白酶谱 的活性电泳，将不同的蛋白酶分离开，同时不影响蛋白酶自身的活性，然后运用含蛋白酶抑 制剂的底物浸泡方法，让不同类型的蛋白酶抑制剂分别与蛋白酶作用，通过染色与否判断 蛋白酶的种类。
[0028] 2、本发明方法能够对不同蛋白酶进行定性，通过活性电泳将蛋白酶一一分离，让 它们与抑制剂单独作用，可以很准确的确认蛋白酶的种类，传统方法则完全做不到这一点。
[0029] 3、对特定蛋白酶进行定性分析时，本发明省去了分离纯化蛋白酶的繁琐步骤，只 需根据其蛋白酶谱，就可以结论，从而在耗时上比传统方法大大的缩短了。
[0030] 4、本发明的方法重复性好，灵敏度高，活性条带测定准确；因为电泳技术已经很成 熟，而且准确性、重复性、灵敏度都是公认的。
[0031] 5、采用本发明方法之后的结果，清晰直观，一目了然，通过电泳图片中条带的染色 与否可以很轻松准确的得出结论。
[0032] 6、本发明的方法可以清晰的辨别细菌分泌的不同的胞外蛋白酶，非常有利于后续 的蛋白酶鉴定及有目的的纯化工作。
[0033] 7、本发明的方法还可以用于各种蛋白酶类型的检测，有广阔的应用空间。

【专利附图】

【附图说明】
[0034] 图1为本发明方法检测假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. SJN2)胞外蛋白酶 液加入不同抑制剂后的电泳染色图谱；
[0035] 图2为本发明方法检测枯草杆菌Bacillus sp. SQN6-1胞外蛋白酶液加入不同抑 制剂后活性电泳图谱的比较；
[0036] 图3为本发明方法检测胰蛋白酶液加入不同抑制剂后活性电泳图谱的比较；
[0037] 图4为本发明方法检测胶原蛋白酶液加入不同抑制剂后活性电泳图谱的比较；
[0038] 图5为蛋白酶抑制剂的不同浓度的电泳染色图谱；
[0039] 由图5可知，蛋白酶抑制剂浓度为5mM时效果最好。

【具体实施方式】
[0040] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0041] 本发明使用的试剂：丙稀酰胺、Ν，Ν' -甲叉双丙稀酰胺、SDS、过硫酸铵（Sigma)， Tris(Sigma进口分装），甘氨酸（Sigma进口分装），酪蛋白、明胶（Sigma进口分装）， 0P (1，10-邻菲罗啉，Aladdin)，PMSF (苯甲基磺酰氟，Sigma)，其他试剂均为普通市售产品。
[0042] 实施例1 :采用本发明方法检测海洋假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. SJN2)胞外蛋白酶。海洋假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. SJN2)为本实验室分离 自海口假日海滩潮间带海沙的菌株。
[0043] 步骤如下：
[0044] (1)将假交替单胞菌划线接种于固体培养基，在18°C条件下活化培养48h，然后接 种于5ml液体LB培养基中，在18°C、200rpm的条件下震荡培养24h，然后按5% (v/v)的接 种量接种于l〇〇ml的发酵培养基中，在18°C、200rpm的条件下震荡培养4天，lOOOOrpm离 心，制得发酵液；
[0045] 上述固体培养基组分如下，均为重量份：
[0046] 蛋白胨1份，酵母粉0. 5份、1. 5份琼脂，蒸馏水100份，pH为7. 5?8. 0 ;
[0047] LB培养基组分如下，均为重量份：
[0048] 蛋白胨1份，酵母粉0. 5份，蒸馏水100份，pH为7. 5?8. 0 ;
[0049] 发酵培养基组分如下，均为重量份：玉米粉1分，麸皮0. 5份，豆柏1份，Na2HP040. 4 份，ΚΗ2Ρ040· 03 份，CaCl20. 1 份，蒸馏水 100 份，ρΗ7· 5。
[0050] (2)将步骤⑴制得的发酵液在4°C条件下，lOOOOrpm离心lOmin，取上清，制得胞 外酶液；4°C冰箱保存待用。
[0051] (3)配制 12.5 % 分离胶：30 % 凝胶贮备液 1.6ml，1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)1.0ml，蒸馏水1.4ml，10%过硫酸铵25μl，TEMED2.5μl。混匀后立即小 心的将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入lml蒸馏水，以阻止 空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。聚合完成之后，倒掉覆盖液体。配制5%上层浓缩 胶：30%凝胶贮备液 0. 15ml，pH6. 8 的 0. 5mol/L Tris-HClO. 35ml，蒸馏水 0. 5ml，10%过硫 酸铵20 μ 1，TEMED2. 0 μ 1 ;插入梳子，小心避免混入气泡，放置室温下。
[0052] (4)将步骤⑵制得的胞外酶液20 μ 1与5 μ 1加样缓冲液（使用的加样缓冲液配 方为：60mMTris-HCl pH6. 8、SDS2%、溴酚蓝0. 1%、甘油25%组成）混匀，样品不在沸水浴 中加热。电泳采用垂直板式不连续系统电泳方法，在Mini PR0TAIN3小型垂直电泳槽和蛋 白质电泳仪电泳仪上进行。在冰浴中稳压120V电泳，分离样品直至溴酚蓝指示剂到达胶的 最前沿。
[0053] (5)电泳结束后，将步骤⑷得到的电泳凝胶用预冷的Triton X-100 (2. 5% )洗 三次，每次15min。然后用预冷的蒸馈水漂洗数次去除残留的Triton X-100。
[0054] (6)将步骤（5)清洗好的胶浸泡在用pH8. 0的Tris-HCl缓冲液配制的含有0. 2% 底物以及终浓度为5mM的蛋白酶抑制剂的溶液中，37°C恒温震荡浸泡lh，然后用蒸馏水将 胶上残留的底物冲洗干净，用0.1% (w/v)的考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，然后用脱色 液脱色直至透明条带清晰。其中染色液配方为：lg考马斯亮蓝R-250, 350ml乙醇，100ml乙 酸，加水至l〇〇〇ml ;脱色液配方为：250ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml。酶谱条带如 图1所示。0P特异性结合二价金属离子，可以抑制金属蛋白酶活性，PMSF为丝氨酸蛋白酶 抑制剂，所以可以从图1中清楚的看出，其中5条为丝氨酸蛋白酶条带，因为加入PMSF后其 活性条带消失，有4条为金属蛋白酶，在含有0P的活性电泳图谱上降解带消失，说明被0P 强烈的抑制了，丧失了酶活性。
[0055] 实施例2 :采用本发明的方法检测海洋细菌（Bacillus sp. SQN6-1)胞外蛋白酶的 各操作步骤同实施例1，发酵培养时间为72小时。海洋Bacillus sp. SQN6-1为本实验室分 离自海口假日海滩海水的菌株。步骤同实施例1。蛋白酶谱条带如图2所示。0P特异性结 合二价金属离子，可以抑制金属蛋白酶活性，PMSF为丝氨酸蛋白酶抑制剂，所以可以从图2 中清楚的看出，其中3条为丝氨酸蛋白酶条带，因为加入PMSF后其活性条带消失，有1条为 金属蛋白酶，在含有0P的活性电泳图谱上降解带消失，说明被0P强烈的抑制了，丧失了酶 活性。
[0056] 实施例3 :采用本发明的方法检测胰蛋白酶Trypsin的各操作步骤同实施例1，所 不同的是采用购买的上海生工的商品酶制剂，胰蛋白酶Trypsin,本实验目的是建立实验方 法，胰蛋白酶是典型的丝氨酸蛋白酶，能够被PMSF抑制剂抑制，但是抑制剂0P对其酶活并 没有影响。胰蛋白酶谱条带如图3所示。胰蛋白酶为典型的丝氨酸蛋白酶，底物溶液加入 PMSF，保温孵育后其活性条带完全消失，而在含有0P的活性电泳图谱上降解带没有变化。
[0057] 实施例4 :采用本发明的方法检测胶原蛋白酶Collagenase蛋白酶的各操作 步骤同实施例1，所不同的是采用购买的Invitrogen公司的商品酶制剂，胶原蛋白酶 Collagenase,本实验目的是建立实验方法，胶原蛋白酶是典型的金属蛋白酶，能够被0P抑 制剂抑制，但是抑制剂PMSF对其酶活并没有影响。胶原蛋白酶谱条带如图4所示。胶原蛋 白酶为典型的金属蛋白酶，底物溶液加入PMSF，保温孵育后其活性条带基本没有变化，而在 含有0P的活性电泳图谱上降解带完全消失，说明胶原蛋白酶的活性被0P所抑制。
【权利要求】
1. 一种蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方法，其特征在于，包 括以下步骤： a. 制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝胶； b. 蛋白酶样品与不含β_巯基乙醇的加样缓冲液混匀后加样，且加样时样品不在沸水 浴中加热； c. 电泳； d. 洗胶； e. 将胶放入含有不同蛋白酶抑制剂的底物溶液中浸泡； f. 反应显色。
2. 根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方 法，其特征在于， 步骤a制备不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酰胺凝胶的过程如下：配制质量浓度为 12. 5% 的分离胶：30% w/v 凝胶吧备液 1. 6ml，ρΗ8· 8 的 1. 5mol/L Tris-HCll. Oml，蒸馈 水1. 4ml，10% w/v过硫酸铵25 μ 1，TEMED2. 5 μ 1 ;混匀后立即将分离胶注入准备好的玻 璃板间隙中，用滴管轻轻在其顶层加入lml蒸馏水，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑 制作用；聚合完成之后，倒掉覆盖液体；配制5 % w/v的上层浓缩胶：30% w/v凝胶贮备 液 0· 15ml，ρΗ6· 8 的 0· 5mol/L Tris-HClO. 35ml，蒸馏水 0· 5ml，10% w/v 过硫酸铵 20μ 1， TEMED2. 0μ 1 ;插入梳子，避免混入气泡，放置室温下。
3. 根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方 法，其特征在于， 步骤b中使用的不含β-巯基乙醇的加样缓冲液配方为：60mM Tris-HCl ρΗ6.8、 SDS2%w/v、溴酚蓝0· l%w/v、甘油25% v/v组成，加样时样品和加样缓冲液的体积比为4 : 1〇
4. 根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方 法，其特征在于， 步骤c中电泳缓冲液为pH8. 8的Tris-甘氨酸缓冲液；电泳在冰浴中进行；采用垂直板 式不连续系统电泳方法，5mA稳流进样后，10mA稳流分离样品直至溴酚蓝指示剂到达胶的 最前沿。
5. 根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方 法，其特征在于， 步骤d中电泳结束后，用预冷的2. 5% Triton X-lOOv/v将胶洗三次，每次15min ;然后 用预冷的蒸馏水漂洗数次去除残留的Triton X-100。
6. 根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方 法，其特征在于， 步骤e中将胶浸泡在用Tris-HCl缓冲液配制的含有5mM蛋白酶抑制剂和质量浓度为 0.1-2%底物的溶液中，30-401：温浴1-311。
7. 根据权利要求6所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方 法，其特征在于， 将胶浸泡在用PH8. 0的Tris-HCl缓冲液配制的含有5mM蛋白酶抑制剂和质量浓度为 0. 1 %底物的溶液中，37°c温浴lh后用蒸馏水将胶上残留的底物冲洗干净。
8. 根据权利要求1或6或7所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的 应用方法，其特征在于，蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟，1，10-邻菲啰啉或EDTA。
9. 根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方 法，其特征在于， 步骤f的具体过程为：用〇. 1 % w/v的考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，然后用脱色液 脱色直至透明条带清晰，其中染色液配方为：lg考马斯亮蓝R_250,350ml乙醇，100ml乙酸， 加水至l〇〇〇ml ;脱色液配方为：250ml乙醇，100ml乙酸，加水至1000ml。
10. 根据权利要求1所述的蛋白酶谱电泳检测方法在快速鉴定蛋白酶种类上的应用方 法，其特征在于，蛋白酶样品来源于将细菌菌株接种于发酵培养基，在相应培养条件下震荡 培养3?4天，4°C，13000rpm离心lOmin后得到的上清液，或是其他来源的蛋白酶液。
【文档编号】G01N27/447GK104122317SQ201410309658
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】何海伦, 刘丹, 武翠玲, 杨兴昊, 吴日帮, 黄嘉封, 黄雅雯 申请人:中南大学