专利名称：用于快速检测atp的荧光共振体系的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和快速诊断检测领域，特别涉及用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，适用于低浓度ATP的快速检测以及细胞生物学线粒体功能等方面的应用。
背景技术：
三磷酸腺苷(ATP)存在于从微生物到高等动植物细胞所有的生物体中。ATP在细胞体内主要作用是提供能量，参与体内脂肪、蛋白质、糖和核酸的代谢，是机体能量的重要来源，在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用。ATP作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用，可作为细胞活性的一个重要标志物。ATP也常作为微生物污染的一个指标，通过检测ATP含量，可以检测食品、水、啤酒、药品、化妆品等样品中的微生物含量，从而反应出其受污染的程度。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成ATP的主要场所，通过监测活细胞线粒体内ATP含量的改变，可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用。传统的ATP检测方法有生物发光法、高效液相色谱法和同位素示踪法等。其中高效液相色谱法操作复杂且检测时间较长；同位素示踪法虽检测灵敏度较高，但污染较大限制其应用。采用生物发光方法是目前较为流行的方法之一，该方法基于萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)催化荧光素氧化，消耗ATP，发出光子的高效发光反应，具有发光效率极高、发光量与ATP含量呈很好的线性关系的特点，而ATP含量是萤光素氧化反应中的限制因素，光的强度与样品中所含的ATP量成正比，需利用高灵敏度的仪器测定光的强度进行定量分析。而目前众多的ATP检测方法多适用于体外ATP检测，对活细胞线粒体内ATP的检测涉及较少。

发明内容
为了克服上述现有技术的不足、提高ATP检测的灵敏度以及实现对细胞内ATP的适时监控，本发明的目的在于提供用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，利用ATP与其配体链(aptamer)的特异性结合原理，利用荧光能量共振转移技术，通过检测QDs与配对荧光染料的荧光强度比值变化，实现对ATP的快速检测。为实现上述目的，本发明通过以下的技术方案实现，用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤:步骤一:准备一种Cy3突光标记的ATP-aptamer适配体，ATP-aptamer适配体为3’ _Cy3 修饰的 DNA 适配体，其序列信息为:5’ -ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3_3’ ；步骤二:将QDs与ATP-aptamer适配体互补链进行偶联反应,得到QDs-分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点(COOH-QDs)，浓度为IuM ；ATP适配体互补链为5’-NH2- (CH2) 12修饰的 DNA，其序列信息为:5’ -NH2- (CH2) 12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT_3’ (ProbeDNA，DNAp)；
步骤三:将步骤2得到的QDs-分子探针与Cy3荧光标记的ATP适配体反应，得到ATP适配体与互补链相互作用后的用于检测ATP的荧光共振体系。本发明采用能量共振转移原理，以带有荧光染料Cy3标记的ATP适配体与量子点标记的ATP适配体互补链，通过杂交反应形成双链，构建能量共振转移体系。利用ATP与ATP适配体特异性识别结合的原理，以量子点为能量供体，Cy3为能量受体进行能量共振转移，检测荧光信号强度比值改变。在无ATP存在的条件下，与QDs偶联的ATP适配体互补链与Cy3标记的ATP适配体形成双链进行能量转移，QDs荧光下降，Cy3荧光增强；当有ATP存在时，ATP与ATP适配体特异性识别，双链解体，能量共振转移体系降低或消失，QDs荧光增强，Cy3荧光降低，从而实现对ATP的快速检测。本发明利用了 ATP与其配体链(aptamer)特异性结合的特点，结合能量共振转移技术，实现了对ATP的快速检测，为ATP的体外检测监控提供了一种新的方法本发明设计了一种快速、高灵敏度检测ATP的体系。以QDs标记的DNA-aptamer为分子探针，利用荧光能量共振转移原理，通过检测QDs与配对荧光染料的荧光强度比值变化，从而实现对ATP进行定量检测，可以提高ATP检测灵敏度、缩短检测时间，降低成本。


图1为偶联反应原理示意图。图2为荧光共振体系反应原理示意图。图3为QDs发射谱和Cy3激发谱示意图。图4为偶联杂交后终产物QDs-DNAp-Cy3进行荧光光谱扫描得到的谱图。图5为荧光共振体系可用于检测ATP原理示意图。图6是对于不同浓度的ATP系统的检测结果示意图。图7是根据图6的光谱数据，计算的体系在检测不同浓度的atp时候的响应结果。图8是在适当浓度范围内的标准曲线，以显示整个系统的线性范围。
具体实施例方式下面结合附体对本发明的结构原理和工作原理做详细叙述。用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤:步骤一:准备一种Cy3突光标记的ATP-aptamer适配体；ATP_aptamer适配体为3’-Cy3修饰的DNA适配体，浓度为0.2uM_luM，其序列信息为:5’-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3，；步骤二:将QDs与ATP-aptamer适配体互补链进行偶联反应,得到QDs分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点(COOH-QDs)，浓度为IuM ；ATP适配体互补链为5’-NH2- (CH2) 12修饰的 DNA，浓度为 10-500uM，其序列信息为:5’-NH2-(CH2) 12_ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’ (Probe DNA, DNAp)。步骤三:将步骤2得到的QDs分子探针与Cy3荧光标记的ATP适配体反应，得到ATP适配体与互补链相互作用后的用于检测ATP的荧光共振体系。本发明中，偶联反应按如下方法制备，原理示意详见图1:将COOH-QDs加入到反应器中，300rpm, 5min,震荡混勻；加入计算好用量的EDC溶液和sulfo-NHS (10mg/mL, IOmM硼酸盐缓冲液，pH7.4)活化30min ;加入计算好用量的DNAp,继续震荡混合均勻，300rpm,室温反应2h (若室温较低，可将搅拌式加热器的温度调至25°C)。反应结束，用0.22 μ m针头式滤器将样品过滤，或者12000rpm离心3min除团聚；用超滤管将样品浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，终产物(QDs-DNAp)复溶于适当的目标偶联物缓冲液中。反应用量:
权利要求
1.用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一:准备一种Cy3突光标记的ATP-aptamer适配体,ATP-aptamer适配体为3’_Cy3修饰的 DNA 适配体，其序列信息为:5’ -ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-Cy3-3’ ； 步骤二:将QDs与ATP-aptamer适配体互补链进行偶联反应,得到QDs-分子探针，QDs为羧基表面水溶性量子点(COOH-QDs)，浓度为IuM ；ATP适配体互补链为5’ -NH2-(CH2) 12修饰的 DNA，其序列信息为:5’-NH2-(CH2) 12-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3’ (Probe DNA,DNAp)； 步骤三:将步骤2得到的QDs-分子探针与Cy3荧光标记的ATP适配体反应，得到ATP适配体与互补链相互作用后的用于检测ATP的荧光共振体系。
全文摘要
用于快速检测ATP的荧光共振体系的制备方法，包括以下步骤步骤一准备一种Cy3荧光标记的ATP-aptamer适配体；步骤二将QDs与ATP-aptamer适配体互补链进行偶联反应，得到QDs分子探针；步骤三将步骤2得到的QDs分子探针与Cy3荧光标记的ATP适配体反应，得到ATP适配体与互补链相互作用后的用于检测ATP的荧光共振体系。本发明利用了ATP与其配体链(aptamer)特异性结合的特点，结合能量共振转移技术，实现了对ATP的快速检测，并且实现了对线粒体内ATP浓度变化的实时监控，为ATP的体外及体内检测监控提供了一种新的方法。
文档编号G01N21/64GK103207166SQ20121057003
公开日2013年7月17日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者李政, 彭年才, 刘小龙 申请人:西安交通大学