专利名称：甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒的制作方法
甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒
技术领域：
本发明涉及食品检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及甘氨酸测定方法及其试齐U盒。
背景技术：
甘氨酸为非人体必需氨基酸。甘氨酸有独特的甜味，能缓和酸、碱味，掩盖食品中添加糖精的苦味并增强甜味。人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。甘氨酸不能被人体利用，只能分解转化为热能，这样会增加肝脏负担。而分解产物中的含氮化合物要通过尿液排出体外，又会增加肾脏负担。如果大量、长期食用这类食品，可能造成肝肾损伤。部分含乳饮料企业为提高产品中蛋白质含量，在生产加工中违规使用甘氨酸，对青少年及儿童的正常生长发育很容易带来不利影响。按照我国《食品添加剂使用卫生标准》GB2760规定，甘氨酸在作为食品添加剂只允许在调味剂与豆奶中使用，且最高限量为每公斤1克，但在含乳饮料中不允许使用。

发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种甘氨酸的测定方法。本发明的另一个目的是提供一种甘氨酸测定试剂盒。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明的方法是一种采用二倍扩增法、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定甘氨酸的方法。本发明甘氨酸测定方法的的技术原理是根据下述氰化氢合成酶、丙酰辅酶A羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的系列催化反应完成 甘氨酸+2辅酶氰化氢合成酶氰化氢+ 二氧化碳+2还原型辅酶二氧化碳+腺苷三磷酸+丙酰辅酶A丙酰辅酶A羧化酶腺苷二磷酸+磷酸根+甲基苹果酰辅酶A磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油酵-3-磷酸脱氢酶甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶本发明的方法利用氰化氢合成酶(hydrogen cyanide synthase ；EC 1. 4. 99. 5)酶 (偶)联丙酰辅酶 A 羧化酶(propionyl-CoA carboxylase ；EC 6. 4. 1. 3)、甘油醛 _3_ 磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 59)酶促反应终点法。 氰化氢合成酶酶解甘氨酸反应产生二氧化碳，再通过(偶)联合丙酰辅酶A羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，这样可以通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算甘氨酸的浓度大小。本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种甘氨酸的测定方法。该甘氨酸测定方法的步骤如下A、样品准备A. 1标准样品的制备将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将甘氨酸浓度调整到1毫摩尔/升，得到的溶液作为标准样品；A. 2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中；A. 3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升；B、试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、氰化氢合成酶、丙酰辅酶A羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷三磷酸、丙酰辅酶A与甘油醛-3-磷酸，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、 0. l-5mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-lOOmmol/L、1-lOOmmol/L 与 l-100mmol/L ；C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)空白样品的吸光度随时间的变化；F、数据处理由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到
甘氨酸的含量
权利要求
1.一种利用二倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸浓度测定方法，其测定的技术原理是根据下述氰化氢合成酶、丙酰辅酶A羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的系列催化反应完成甘氨酸+2辅酶氰化氢合成酶氰化氢+ 二氧化碳+2还原型辅酶二氧化碳+腺苷三磷酸+丙酰辅酶A丙酰辅酶A羧化酶腺苷二磷酸+磷酸根+甲基苹果酰辅酶A 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油酵-3-磷酸脱氢酶甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶。
2.一种甘氨酸的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下 2. 1样品准备2. 1. 1标准样品的制备将一定量的甘氨酸溶于水或缓冲液中，再将其浓度调整到1毫摩尔/升； 2. 1.2待测样品的制备待测液体样品直接测试，无须预处理；将一定量的待测固体样品像制备标准样品一样溶于水或缓冲液中； 2. 1.3空白样品所述的水或缓冲液作为空白样品，其甘氨酸浓度为0毫摩尔/升； 2. 2试剂溶液的制备分别移取或称取缓冲液、稳定剂、辅酶、氰化氢合成酶、丙酰辅酶A羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷三磷酸、丙酰辅酶A与甘油醛-3-磷酸，然后将它们混合均勻，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-5mmol/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 与 l-100mmol/L ；2. 3待测样品与在步骤2. 2)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/500进行混合，在温度15-45°C下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm(如果受仪器限制，可以不设副波长)下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；2. 4在与步骤2. 3)同样的条件下测定步骤2. 1. 1)标准样品的吸光度随时间的变化； 2. 5在与步骤2. 3)同样的条件下测定在步骤2. 1. 3)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化； 2. 6数据处理由步骤2. 3-2. 5)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到甘氨酸的含量
3.根据权利要求1、2所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，待测样品、所述标准样品与所述空白样品由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定测定方法为终点法，温度37°C，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘氨酸样品与试剂的体积比例为1/10-1/500，反应方向为正反应，延迟时间1/0分钟，检测时间4/5分钟。
4.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于，所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠等防腐剂的稳定剂；所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的辅酶是一种或多种选自NADP+、 NAD+ 或 thio-NAD+ 的辅酶。
5.根据权利要求1、2或3所述的测定方法，其特征在于 5. 1所述的试剂溶液配制成如下单剂试剂它是由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、丙酰辅酶A、甘油醛-3-磷酸、氰化氢合成酶、丙酰辅酶A羧化酶与甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成的； 5. 2所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、丙酰辅酶A与甘油醛-3-磷酸组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、氰化氢合成酶、丙酰辅酶A羧化酶与甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成的；其中辅酶、氰化氢合成酶、丙酰辅酶A羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷三磷酸、丙酰辅酶A、甘油醛-3-磷酸在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。5.3所述的试剂配制成如下三剂试剂试剂1，它是由所述的缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷三磷酸、丙酰辅酶A与甘油醛-3-磷酸组成的；试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、丙酰辅酶A羧化酶与甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成的；试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂与氰化氢合成酶组成的； 其中辅酶、氰化氢合成酶、丙酰辅酶A羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷三磷酸、丙酰辅酶A、甘油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。
6.一种甘氨酸测定试剂盒，其特征在于6.1它由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L辅酶0. l-5mmol/L氰化氢合成酶1000-80000U/L丙酰辅酶A羧化酶1000-80000U/L甘油酸-3-磷酸脱氧酶1000-80000U/L腺苷三磷酸1-lOOmmol/L丙酰辅酶A1-lOOmmol/L甘油酸-3-磷酸1-lOOmmol/L。·6. 2根据权利要求6. 1所述的甘氨酸测定试剂盒，其特征在于它有组成如下的试剂1 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L辅酶0. l-5mmol/L腺苷三磷酸1-lOOmmol/L丙酰辅酶A1-lOOmmol/L甘油酸-3-磷酸1-lOOmmol/L ； 组成如下的试剂2 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L氰化氧合成酶1000-80000U/L丙酰辅酶A羧化酶1000-80000U/L甘油酸-3-磷酸脱氧酶1000-80000U/L。·6. 3根据权利要求6. 1所述的甘氨酸测定试剂盒，其特征在于它有组成如下的试剂1 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L辅酶0. l-5mmol/L腺苷三磷酸1-lOOmmol/L丙酰辅酶A1-lOOmmol/L甘油酸-3-磷酸1-lOOmmol/L ； 组成如下的试剂2 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L丙酰辅酶A羧化酶1000-80000U/L甘油酸-3-磷酸脱氧酶1000-80000U/L ； 组成如下的试剂3 缓冲液20-500mmol/L稳定剂0.001-7mol/L氰化氧合成酶1000-80000U/L。
全文摘要
本发明涉及利用二倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的甘氨酸含量的测定方法、试剂的组成及成分，其测定的技术原理是依据氰化氢合成酶、丙酰辅酶A羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的系列催化反应完成，本发明还涉及一种甘氨酸测定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于食品检验。
文档编号G01N33/68GK102298004SQ201010209438
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司